PCR儀專題
PCR儀主要適用于醫(yī)學(xué)、司法科學(xué)、生物技術(shù)、分子生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)、臨床診斷、流行病學(xué)、遺傳學(xué)、基因檢測等領(lǐng)域。PCR儀可分為梯度PCR儀、原位PCR儀、實時熒光定量PCR儀、普通PCR儀。下面將為您詳細(xì)介紹PCR儀：
一、PCR儀分類
1.梯度PCR儀：是由普通PCR儀衍生出的帶梯度PCR功能的基因擴增儀。PCR反應(yīng)能否成功，退火溫度是關(guān)鍵，梯度PCR儀每個孔的溫度可以在指定范圍內(nèi)按照梯度設(shè)置，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出[much]適反應(yīng)條件。
2.原位PCR儀：可用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴增儀，可保持細(xì)胞組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置上進行基因擴增。
3.實時熒光定量PCR儀：它的的發(fā)明實現(xiàn)了榮獲諾貝爾化學(xué)獎的PCR核酸檢測、分子診斷的技術(shù)飛躍。是在普通PCR儀的基礎(chǔ)上增加一個熒光信號采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量PCR儀。
4.普通PCR儀：可應(yīng)用于科研研究，教學(xué)，醫(yī)學(xué)臨床，檢驗檢疫等機構(gòu)，對目的基因退火溫度的擴增。
二、PCR技術(shù)的應(yīng)用舉例
1.研究：基因克隆;DNA測序;分析突變;基因重組與融合;鑒定與調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列;轉(zhuǎn)座子插入位點的繪圖;檢測基因的修飾;合成基因的構(gòu)建;構(gòu)建克隆 或表達載體;檢測某基因的內(nèi)切酶多態(tài)性。
2.免疫學(xué)：HLA分裂;T細(xì)胞受體或抗體多樣化的定性;自身免疫病基因作圖;淋巴因子定量
人類基因組工程：用散布重復(fù)序列產(chǎn)生DNA標(biāo)志;遺傳圖譜的構(gòu)建(檢測DNA、 多態(tài)性或精子繪圖);物理圖譜的構(gòu)建;測序，表達圖譜。
3.診斷：細(xì)菌(螺旋體、支原體、衣原體、分支桿菌、立克次氏體、白喉桿菌、致病大腸桿菌、痢疾桿菌、嗜水氣單胞菌和艱難梭菌等);病毒(HTLV、HIV、 HBV、 HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、輪狀病毒、細(xì)小病毒B19);寄生蟲(瘧疾 等);人遺傳病(Lesh-Nyhan綜合癥、地貧、血友病、BMD、DMD、囊性纖維化等)。
4.法醫(yī)：犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析;HLA-DQ。
5.腫瘤：胰癌、結(jié)腸癌、肺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、血液惡性腫瘤。
6.組織和群體生物學(xué)：遺傳聚類研究;動物保護研究;生態(tài)學(xué);環(huán)境科學(xué);實驗遺 傳學(xué)古生物學(xué)：考古與博物館標(biāo)本分析。
7.動物學(xué)：動物傳染病的診斷等
8.植物學(xué)：檢測植物病原等
三、PCR儀使用說明：
（一）試劑PCR儀
1.引物：決定擴增的特異性。根據(jù)檢測的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生物都有自己特異的引物。
2.耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來的，能耐受高溫90℃-100℃。
3.10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl（pH8.4,20℃）150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購買。
4.5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度理想地用UV吸收法[accurate測定。現(xiàn)用dNTP溶液均有商品化產(chǎn)品。
5.DNA模板：用處理液將待測標(biāo)本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標(biāo)本中被檢測的DNA。
（二）操作程序PCR儀
過去標(biāo)準(zhǔn)的PCR操作程序是將PCR儀必需反應(yīng)成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進行循環(huán)擴增。具體如下：
1.向一微量離心管中依次加入
DNA模板 102-105拷貝
引物 各1μmol/L
dNTP 各200μmol/L
10×PCR緩沖液 1/10體積
ddH2O 補到終體積（終體積50μl-100μl）
混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。以上步驟僅在實驗研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應(yīng)體積為20-25μl，只要試驗人員加入處理好的樣品就可以了。
2.加石蠟油50-100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97℃變性10min。
3.冷至延伸溫度時，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應(yīng)液充分混合。現(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應(yīng)液中。
4.PCR儀的循環(huán)程序為：94℃變性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循環(huán)30-35次。[much]后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。
PCR儀尚可用于組織標(biāo)本DNA的擴增。由于固定組織標(biāo)本的DNA常發(fā)生降解，就給常用的分析方法如Southern轉(zhuǎn)印雜交等帶來一定困難。
在應(yīng)用PCR方法檢測RNA病毒時，首先應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA才能進行擴增，因為PCR只能對DNA模板進行擴增，我們把這種RNA的PCR反應(yīng)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR，簡稱RT-PCR。把由RNA轉(zhuǎn)化成DNA的過程叫做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄需要在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下完成。
四、PCR儀詳細(xì)操作步驟：
1、開機：打開開關(guān)，視窗上顯示“SELF TEST”，顯示10秒中后，顯示RUN-ENTER菜單： “-RUNENTER PROGRAM PROGRAM ”準(zhǔn)備執(zhí)行程序。
2、放入樣本管，關(guān)緊蓋子。
3、如果要運行已經(jīng)編好的程序，則直接按《Proceed》，用箭頭鍵選擇已儲存的程序，按《Proceed》，則屏幕顯示：“- ENABLE DISABLE HEATED LID” 按《Proceed》選擇ENABLE，則開始執(zhí)行程序。
4、如果要輸入新的程序，則在RUN-ENTER菜單上用箭頭鍵選擇ENTER PROGRAM，按《Proceed》，屏幕顯示 “ -NEWLIST EDITDELET”，按《Proceed》
1）選擇NEW，命名新的程序，[much]多8個字母，輸入后按《Proceed》確認(rèn)。
2）輸入程序步驟：名字輸入后，顯示“ STEP1 _TEMP GOTO OPITON END”，按《Proceed》則可以輸入溫度（0～100℃），按《Proceed》確認(rèn)后，則可以輸入孵育時間，用《Select》鍵移動光標(biāo)，輸入數(shù)字，完成后按《Proceed》確認(rèn)，跳到下一步，輸入方式同上。
3）選擇GOTO，輸入循環(huán)步驟時鏈接到第幾步（循環(huán)數(shù)[much]多可達9999次）（為實際循環(huán)數(shù)-1)。
4) 選擇option，顯示“ STEP EXTENDI NCREMENT SLOPE ”再選擇increment，按《Proceed》確認(rèn)，輸入初始的溫度，確認(rèn)后輸入時間，按《Proceed》確認(rèn)，然后輸入每個循環(huán)增加或減少的溫度，增加用正值，減少用負(fù)值（-0.1℃～6℃），按《Proceed》確認(rèn)。選擇extend，按《Proceed》確認(rèn)，輸入每個循環(huán)增加或減少的時間（-60～60秒），按《Proceed》確認(rèn)。
選擇slop（指溫度上升或下降的速率），輸入溫度的改變值（-0.1～1.5℃）按《Proceed》確認(rèn)，然后輸入加熱或致冷的速度，按《Proceed》確認(rèn)。
4）選擇End，輸入結(jié)束步驟。
5、輸入完成的程序后，到RUN-ENTER菜單，選擇新程序，開始運行。
6、其它：用《pause》可以暫停一個運行的程序，再按一次繼續(xù)程序。用《stop》或《Cancel》可停止運行的程序。
五、PCR儀使用注意事項：
1. PCR儀應(yīng)放置在水平堅固的平臺上，外界電源系統(tǒng)電壓要匹配，并要求有良好的接地線。
2.環(huán)境溫度保持在23℃左右，濕度保持在60％左右。
3.應(yīng)配備功率≥3000W的穩(wěn)壓器。
4.應(yīng)定期清潔維護。
5.使用時應(yīng)嚴(yán)格遵守上述使用步驟。
六、PCR儀維護保養(yǎng)方法：
1.樣品槽應(yīng)每月定期進行清理（在樣品槽中加入少量95％乙醇，用棉簽擦洗反應(yīng)孔，用干棉簽吸干乙醇）。
2.每月應(yīng)定期對熱蓋進行清潔。
3.校正ROI光路以便確信結(jié)果仍然是優(yōu)化的。
4.每月檢查樣品槽的熒光污染，如有需要隨時進行。
七、PCR儀常見故障處理方法：
1.使用PCR管，反應(yīng)后部分PCR管內(nèi)反應(yīng)液有明顯蒸發(fā)
解決方法：a.確保使用高質(zhì)量的PCR管或使用我們推薦的PCR管
b.在樣品臺的四角放置四個同樣的空PCR管，以保證熱蓋壓在各PCR管上的壓力均勻
2. 使用的微孔板，反應(yīng)后反應(yīng)液有明顯蒸發(fā)
a.確保使用高質(zhì)量的微孔板，反應(yīng)前要嚴(yán)格密封
b.確保蓋緊熱蓋，適當(dāng)提高熱蓋的溫度
c.增大反應(yīng)體積
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